一、PCR技術(shù)服務(wù)概述及原理

　　PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA為模板，以特定的核酸片段即PCR引物為擴(kuò)增起點(diǎn)和終點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，在體外體系中復(fù)制出大量與母鏈模板中所需的DNA片段互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。

　　PCR的大特點(diǎn)是其擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性、擴(kuò)增效率的靈敏性、擴(kuò)增程序的簡(jiǎn)便性。引物序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。PCR技術(shù)是一種DNA體外合成放大技術(shù)，具有擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增特異性高，擴(kuò)增體系和技術(shù)簡(jiǎn)便成熟的特點(diǎn)，是當(dāng)今生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的一項(xiàng)技術(shù)。

　　二、PCR技術(shù)服務(wù)的循環(huán)步驟

　　PCR反應(yīng)過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)溫度循環(huán)變化的過(guò)程，一般包括變性---退火---延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟，其基本步驟如下：

　　(1)模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至92～96℃以上保溫1～3分鐘，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;雖然變性時(shí)間決定于多種因素模板DNA的復(fù)雜性、反應(yīng)管的幾何學(xué)、PCR儀的種類(lèi)甚至反應(yīng)體積，但是實(shí)際經(jīng)驗(yàn)中，94℃保溫3分鐘即可以滿足絕大部分反應(yīng)的需求。另外，對(duì)于GC含量較高的DNA模板，加入甘油、延長(zhǎng)時(shí)間、應(yīng)用核酸類(lèi)似物可以提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。

　　(2)模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，37～65℃保溫0.5～1分鐘，寡核苷酸引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;這一步的溫度取決于引物與靶序列的同源性程度和寡核苷酸引物的堿基組成。引物的摩爾數(shù)由于大于靶序列，因此它們與互補(bǔ)序列的配對(duì)速度在反應(yīng)中比模板雙鏈之間的重新配對(duì)要快幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

　　(3)引物的延伸：DNA模板---引物結(jié)合物體系在68～72℃延伸保溫相應(yīng)時(shí)間(此步驟具體溫度視熱穩(wěn)定DNA聚合酶的種類(lèi)而定，而保溫時(shí)間則在考慮DNA聚合酶效率的基礎(chǔ)上，依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的長(zhǎng)度決定，如目前常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分鐘約可以擴(kuò)增長(zhǎng)度為1Kb左右的DNA片段，因此要擴(kuò)增兩2Kb的DNA片段時(shí)本步驟的保溫溫度應(yīng)設(shè)置為72℃、時(shí)間為2分鐘)，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

　　重復(fù)循環(huán)變性---退火---延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板使得每個(gè)循環(huán)中新擴(kuò)增的目的片段數(shù)量以指數(shù)式增長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)之后，待擴(kuò)目的DNA片段的數(shù)量將被擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。